液相色譜法測定維生素A、維生素D3（VA和VD3）

維生素A（VA）、維生素D3（VD3）、維生素E（VE）和β-胡蘿卜素是維持人體正常生理活動和機(jī)能的脂溶性維生素，缺乏這些維生素會導(dǎo)致多種疾病。流行病學(xué)研究資料表明，脂溶性維生素與癌癥發(fā)生有著相應(yīng)的關(guān)系

  食道癌是世界八大癌癥之一，而我國又是食管癌的高發(fā)地區(qū)，每年因食管癌死亡者約15萬人，但有關(guān)食道癌與脂溶性維生素的關(guān)系尚無相關(guān)報道。通過測定和比較食道癌病人和正常人血清中脂溶性維生素的含量，可以了解食道癌與脂溶性維生素的關(guān)系，為指導(dǎo)病人正確地補(bǔ)充維生素

提供實驗室依據(jù)。目前我國尚無測定血清中脂溶性維生素的標(biāo)準(zhǔn)方法。

HPLC因其具有高分離效能、靈敏快速、可自動化等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛用于食品等樣品中脂溶性維生素的測定，而同時測定人血清中VA、VD3、VE和β-胡蘿卜素四種脂溶性維生素的報道甚少。因此，本課題組擬建立HPLC同時測定VA、VD3、VE和β-胡蘿卜素的方法，并應(yīng)用于食道癌病人和正常人血清樣品的測定，為研究食道癌的發(fā)生與血清中脂溶性維生素之間的關(guān)系提供簡單可行的實驗技術(shù)和數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑液相色譜儀附紫外檢測器、吹氮儀、視黃醇、維生素D3、α-生育酚和β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品  1mg/ml

維生素標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制：分別精密稱取視黃醇、VD3、α-生育酚、β-胡蘿卜素各0.025g于25ml容量瓶中，視黃醇、VD3和α-生育酚用甲醇，β-胡蘿卜素用二氯甲烷溶解并定容到刻度，搖勻備用。

1.2 

實驗方法

1.2.1 

色譜條件   色譜柱：C18柱；柱溫25℃；流動相：甲醇:二氯甲烷:乙腈（10:20:70）；流動相程序：

0~12min  流速1.0~1.5ml/min  線性變化，12min~17min  保持流速 1.5ml/min，17min

流速回到1.0ml/min；檢測 波長切換程序：0~6min為324nm，6min~8 min為263nm，8~12min為291nm，12min后為462nm; 1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別取適量維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動相稀釋成濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)系列，10μl進(jìn)樣測定，以維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或進(jìn)行線性回歸。

1.2.3 樣品測定0.2ml血清中加入0.2ml無水乙醇沉淀蛋白質(zhì)，0.8ml已醚/石油醚混合溶液提取，振搖1min后15000r/min離心2min；取上清液0.6ml，氮?dú)獯蹈桑?/span>0.10ml流動相溶解殘渣，漩渦振蕩器振蕩30s，15000r/min離心2min，取25μl上清液進(jìn)樣測定。標(biāo)準(zhǔn)和樣品色譜圖如圖1